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Polymerase Chain Reaction/ Polymerasekettenreaktion/ PCR

(WeberV)

Die Polymerasenkettenreaktion oder PCR (Polymerase Chain Reaction) ist eine gentechnische Methode zur Vermehrung eines definierten DNA-Fragments. Das Verfahren wurde von Kary Mullis 1984 erfunden, der dafür 1993 den Nobelpreis erhielt (BERG ET AL., 2007). Für die Durchführung der Polymerasenkettenreaktion werden neben geeigneten Primern nur geringste Mengen der zu amplifizierenden DNA benötigt (ORDON, FRIEDT, 1998). Die Primer hybridisieren nach der Denaturatierung der DNA mit komplementären Regionen der DNA und dienen der DNA-Polymerase als Start für die Polymerisation (CHAWLA, 2002). Um eine sequenzspezifisches Annealing der Primer zu erreichen, sind hohe Temperaturen erforderlich, die herkömmliche DNA-Polymerasen inaktivieren. Daher wird die aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus (Taq) isolierte Taq-Polymerase mit einem Aktivitätsoptimum zwischen 75 bis 80 °C verwendet (ODENBACH (HRSG.), 1997). Des Weiteren werden die vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs), die die DNA aufbauen, benötigt (BERG ET AL., 2007). Die PCR läuft in drei Teilabschnitten mit ständiger Wiederholung ab. Damit die PCR ablaufen kann, müssen innerhalb kurzer Zeit die für die einzelnen Reaktionsschritte optimalen Temperaturen erreicht werden. Für diese Aufgabe stehen Thermocycler zur Verfügung. (ORDON, FRIEDT, 1998). Der Ablauf ist in Abb. 2 gezeigt (BERG ET AL., 2007).
Zuerst wird die DNA-Probe durch Erhöhung der Temperatur auf 94°C denaturiert (1) und liegt dann einzelsträngig vor (ODENBACH (HRSG.), 1997). Dieser Vorgang dauert ungefähr eine Minute (GLICK, PASTERNAK, 1995).
Das Reaktionsgemisch wird danach auf die so genannte Annealing-Temperatur, welche je nach Primerlänge zwischen 35-60 °C liegt, abkühlt (ORDON, FRIEDT, 1998). Bei dieser Temperatur binden die Primer (2) an die komplementären Sequenzen der einzelsträngigen DNA (ODENBACH (HRSG.), 1997). Die Polymerisation durch die Taq-Polymerase (3) erfolgt bei 72 °C beginnend an den Primern in 5’ => 3’ Richtung des als Schablone dienenden Stranges (MORTIMER, MÜLLER, 2003). Sie verwendet dabei die im Reaktionsgemisch vorhandenen Nucleosid-Triphosphate (ORDON, FRIEDT, 1998).
Die Synthese läuft im ersten Zyklus über den Bereich der Zielsequenz hinaus. Die daraus folgenden Produkte werden als lange Matrizen bezeichnet (GLICK, PASTERNAK, 1995).
Während des zweiten Zyklus (4) werden die ursprünglichen DNA-Stränge und die im ersten Zyklus synthetisierten Stränge wieder denaturiert und dann mit den Primern hybridisiert. Durch die Bindung des Primers an die komplementäre Basensequenz der langen Matrize entsteht bei erneuter DNA-Synthese ein Produkt (5), das an einem Ende den Primer und am anderen Ende eine Sequenz, die zum zweiten Primer komplementär ist, aufweist (GLICK, PASTERNAK, 1995). Somit ist die Länge dieser Sequenz durch die beiden Primer begrenzt und wird deshalb auch als kurze Matrize bezeichnet (HELDT, 2003). Während der darauf folgenden Zyklen sammeln sich bevorzugt die kurzen Matrizen an, bis diese Stränge im dreißigsten Zyklus bis zu einer Million häufiger sind als die langen Matrizen (GLICK, PASTERNAK, 1995).
Auf diese Weise kann man aus geringsten Ausgangsmengen innerhalb kurzer Zeit Millionen identische Kopien des DNA-Fragments herstellen. Abhängig von der Entfernung der Primerbindungsstellen entstehen Fragmente unterschiedlicher Größe, die nach elektrophoretischer Auftrennung in einem Polyacrylamidgel identifiziert werden können (ODENBACH (HRSG.), 1997). Die Ergebnisse der SSR-Analyse sind Fragmentlängen, die in Basenpaaren angegeben werden und Allele darstellen (PETER, ERHARDT, 2006). Die dabei entstehenden Fragmentmuster beruhen wiederum direkt auf den Unterschieden in der DNA-Sequenz und sind daher spezifisch für den jeweiligen Genotyp (ORDON, FRIEDT, 1998).

Literatur siehe http://cropscience.ch/?p=33

September 7th, 2007
Topic: Crop Science, Plant biotechnology Tags: None

One Response to “Polymerase Chain Reaction/ Polymerasekettenreaktion/ PCR”

  1. The three components of plant breeding | cropscience.ch Says:

    [...] a specific part of a genome which is coding for a specific phenotype. For this DNA hybridization, PCR and markers (AFLP, RFLP, SSR,…) are used. The method is up to know limited view important crops [...]

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